新风口：武汉新型冠状病毒肺炎检测的背后离不开这项技术

——当我们谈不明原因病毒时，我们能学到什么

2020年1月7日21时，央视新闻报道称，病原检测的实验室通过各种方法检出一种新型冠状病毒，获得该病毒的全基因组序列，经核酸检测方法共检出新型冠状病毒阳性结果15例，从1例阳性病人样本中分离出该病毒，电镜下呈现典型的冠状病毒形态。（武汉不明原因肺炎病原体为新型冠状病毒）

检测成功背后的方法离不开病原微生物的宏基因组检测技术（Metagenomic Next-generation sequencing, mNGS）——这项新兴技术也许可以成为解决临床感染相关问题的有力武器，也是科研临床转化的切入点。

一、宏基因组测序相关文献背景

病原微生物的宏基因组检测技术（mNGS）即是检测病原微生物体内包含的所有基因组序列。

2014年，临床研究顶级神刊新英格兰医学（NEJM）杂志主编以“NGS，一个病例如何改变世界”评价了一篇mNGS相关的文章[1]。该研究描述了患有联合免疫缺陷综合症和脑膜炎的男孩，在联合使用了5种抗菌药物仍然无法改善脑积水和癫痫状态，经过脑脊液宏基因组测序，检出圣地罗西钩端螺旋体序列，更改青霉素治疗后痊愈出院。

图片来源于参考文献[1]

上图A，B，C是在患者第三次住院的第13天。图D是在患者通过mNGS正确诊断后，经过青霉素G的7天疗程后的第55天；箭头显示了基底神经节及周围的高信号；图E为第三次入院后2周进行的右额叶活检显示血管周围性病变。图F免疫组化显示T淋巴细胞；图G抗酸染色显示无分枝杆菌；图H染色显示无真菌和钩端螺旋体或其他螺旋体；图J电子显微镜检查显示存在炎症浸润，并且没有包涵体，病毒颗粒或其他微生物迹象。

上图A 为NGS进行全面病原体检测测定的临床实验室工作流程；图B将来自患者脑脊髓液（CSF）样本的总共475个序列读数映射到参考数据库中的最接近的钩端螺旋体基因组，即钩端螺旋体（Bettospiraborgpetersenii）；图C在患者脑脊液中鉴定出的细菌和病毒序列的分布包括丙酸杆菌，网膜病毒和噬菌体，这些细菌和病毒序列通常被认为是非致病性体菌；图D 全长rpoB基因的系统发育分析显示了代表性的血清型，菌株和钩端螺旋体物种的序列，突出显示了在暴发性脑膜脑炎患者（暂时命名为L.santarosai菌株UW [威斯康星大学]）中鉴定出的菌株。

2020年该团队再次在新英格兰发文，招募了因急性脑炎、脑膜炎及脊髓炎住院，但难以进一步明确诊断的病人，共204名儿童和成人，通过对疑难病人的脑脊液样本的mNGS分析，与真实临床世界的传统方案（包括脑脊液及其它样本的检测）的比较，认为针对CSF的mNGS分析比传统的直接脑脊液分析更有可能明确潜在病原体,常规的病原学检查，仍然有27%神经系统感染病例被遗漏。在半数以上的病例中，mNGS诊断对于指导这些患者的治疗是不可或缺的，但检测结果还是要结合临床[2]。

图A显示了研究患者中已确诊的比例和类别。常规临床检查和脑脊液的宏基因组NGS检测后，对204例患者中的103例做出了诊断（50.5％）。在57例患者（27.9％）中，共发现58例感染（粉红色圆圈）。有13例（12.6%）是常规检测不出来的病原体感染。

二、宏基因组测序临床应用前景

作为医生，在临床工作中还要兼顾临床和科研。而mNGS技术则可以成为沟通临床和科研的桥梁。mNGS正在逐步成为临床应用和科学研究的热点。美国FDA于2016年在其NGS感染性疾病诊断策略提到，mNGS可用于病原微生物鉴定，评价是否耐药，是否为毒力标志物[3]。2017年FDA授权二代测序技术（NGS）应用至肿瘤研究领域[4]。而在2019年刊登在中华急诊医学杂志上的《宏基因组诊断技术在急危重症感染应用的专家共识》[5]，也证实了mNGS在中国临床学界的有效应用。难怪Science文章形象地称其将所有微生物进行“一网打尽”。可谓是临床诊治中的有力武器，科研过程中的星火灵感。

图片来源：Fields, Science. 2001, 291, 5507: 1221-1224

三、宏基因组测序助力医生科研

临床研究

mNGS技术在各大测序公司已开展，适用范围明确，操作流程简单，在呼吸科、重症医学科、神经内科、感染科、肿瘤科等科室均有广泛应用前景。上文提到的新英格兰顶级刊物也证明，文章有了新技术的加持，更容易发表在高分杂志上。如果能将目前的临床课题与mNGS、NGS结合，一方面可以诊治临床疑难患者，另一方面可以获得更多感染相关的病原微生物基因组测序数据，进一步启发科研思路。

基础研究

宏基因组学研究助力国自然申请，2019年热词聚焦在“组学”“肠道菌群”“核酸”“生物信息”，对于医生来说，临床样本的搜集能够帮助科学研究，而宏基因组学研究的操作步骤简单，周期短，通过测序能得到海量的数据，再通过更新的数据库进行生物信息学的算法比对，为国自然的临床研究前期基础提供数据支持，提供进一步研究思路，增加中标率。

虽然任何技术都有其局限性，mNGS也仅仅是一种有发展前景的检测。临床诊断需要结合临床要有其他指征去下结论，最终鉴定新型的病原体，结合病原学研究、流行病学调查和临床表现进行专家研判。

但有了mNGS这一项武器，临床医生们就可以在最终时刻，大显神通，精确诊治疑难病例，发表顶级临床文章。而且国内已有测序公司打出了“一次检测，全面覆盖，让微生物检测更简单”的口号，一些大型公司也可以提供专业的病原测序平台。

参考：

[1] Wilson MR, Naccache SN, SamayoaE, Biagtan M, Bashir H, Yu G, Salamat SM, Somasekar S, Federman S, Miller S etal: Actionable diagnosis of neuroleptospirosis by next-generation sequencing. NEngl J Med 2014, 370(25):2408-2417.

[2] Wilson MR, Sample HA, Zorn KC,Arevalo S, Yu G, Neuhaus J, Federman S, Stryke D, Briggs B, Langelier C et al:Clinical Metagenomic Sequencing for Diagnosis of Meningitis and Encephalitis. NEngl J Med 2019, 380(24):2327-2340.

[3] https://www.fda.gov/media/98093/download

[4]https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-unveils-streamlined-path-authorization-tumor-profiling-tests-alongside-its-latest-product-action

[5] Miao, Q., Ma, Y., Wang, Q., Pan,J., Zhang, Y., Jin, W., et al. Microbiological Diagnostic Performance ofMetagenomic Next-generation Sequencing When Applied to Clinical Practice.Clinical Infectious Diseases. 2018, 67(suppl_2), S231–S240.

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